Filogenia molecular e análise in silico do inibidor de protease Bowman-Birk de espécies da subfamília Papilionoideae

Abstract

Fabaceae (Leguminosae) é a terceira maior família de dicotiledôneas. Subdividida em seis subfamílias, constitui a terceira maior família de angiospermas, ficando atrás de Asteraceae e Orchidaceae. Dentre essas subfamílias Papilionoideae se destaca por representar dois terços de todos os gêneros e espécies da família, com aproximadamente 14.000 espécies, 501 gêneros e 32 tribos. Essa subfamília é reconhecida por sua grande importância alimentar, forrageira e biológica, com ampla distribuição nos diversos tipos de biomas. Nesta subfamília também é relatado na literatura a existência do inibidor de protease do tipo Bowman-Birk (BBI) em diversos representantes de Papilionoideae, sendo reconhecido por sua ação inseticida, dentre outras funções importantes nas plantas. Com o surgimento de novas tecnologias de sequenciamento de DNA, bem como os avanços das ferramentas de bioinformática, favoreceu a utilização de inúmeras formas de estabelecer correlações evolutivas entre as espécies desta subfamília. Atualmente, em razão da baixa taxa mutacional dos genomas de cloroplasto (cpDNA), as análises filogenéticas baseadas em cpDNA, tem resolvido as relações entre os principais táxons de Papilionoideae. Nesse sentido, os transcritos de proteínas importantes também podem ser ferramentas para estabelecer correlações entre espécies, uma vez que partem do mesmo princípio de baixa taxa de mutação, bem como identificar, caracterizar e predizer domínios funcionais de proteínas por meio da abordagem in sílico. Com o objetivo de realizar uma reconstrução filogenética de espécies da subfamília Papilionoideae baseada em seis genes plastidiais, foram obtidas sequências completas dos plastomas de espécies da subfamília Papilionoideae e dos genes isolados do banco de dados GenBank. O alinhamento das sequências foram realizadas e a reconstrução filogenética foram realizadas com uso do software MEGA 7. Para reconstrução filogenética foi utilizado o método de Máxima Verossimilhança com suporte estatístico calculado pelo método de bootstrap (BS), com 1000 replicatas. As correlações filogenéticas para subfamília Papilionoideae resultaram em uma árvore monofilética, confirmando a divisão da subfamília em quatro principais clados, NPAAA, ADA, Genistoides e Dalbergioides. O clado ADA foi relacionado como grupo irmão do clado Genistoides, com alto suporte. Foi evidenciado o parafiletismo das tribos Phaseoleae e Millettiae, dentro do clado NPAAA. Também observamos, que apenas as espécies do clado ADA não possuem nódulos rizobianos, o que pode configurar uma possível sinapomorfia para sustentar as relações desse grupo. Da mesma forma, a análise do tempo de divergência sugere que os principais clados de Papilionoideae divergiram a partir do Paleoceno. As sequências da BBI foram recuperadas do banco de dados GenBank, por meio da ferramenta BlastP. Os parâmetros físico-químicos foram avaliados através da ferramenta ProtParam. A identificação de domínios funcionais foi avaliada por meio do servidor Prodom e a estimativa de efeitos mutacionais foi feita por meio do servidor SNAP2. O alinhamento de sequência das proteínas foi realizado por meio do algoritmo ClustalW e a árvore filogenética produzida no software MEGA 7, pelo método de Máxima Verossimilhança. O servidor GalaxyTBM foi utilizado para predição de estrutura das proteínas em modelos 3D. Os resultados obtidos entre as sequências de BBI revelaram dois domínios funcionais, caráter hidrofílico e ponto isoelétrico ligeiramente ácido para todas as espécies analisadas. A análise de agrupamento por Máxima Verossimilhança das espécies da tribo Phaseolea (Papilionoideae) construídas por meio das sequências da proteína BBI, apresentam consistência com a classificação mais recentes para as espécies analisadas. A partir do gráfico de Ramachandran, foi possível verificar que os modelos 3D gerados, evidenciaram excelente qualidade estereoquímica e boa qualidade estrutural. Estas informações em conjunto, podem auxiliar os programas de melhoramento genético dessas culturas, por meio de métodos convencionais ou engenharia genética.